Фермент выделен из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду, содержащую рекомбинантный ген ДНК-лигазы фага T4.

 

Фермент ДНК-лигаза фага T4 предназначен для быстрого лигирования липких и тупых концов фрагментов ДНК. Фермент катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатными и 3'-гидроксильными концевыми группами ДНК.

 

     1 пробирка (200 мкл) - ДНК-лигаза фага T4

     2 пробирки (2x1000 мкл) 2x буфера лигирования с PEG
     1 пробирка (1x1600 мкл) воды

 

Фермент ДНК-лигаза фага T4 и буфер лигирования рекомендуется хранить при -20°C. Перед первым использованием рекомендуется расфасовать буфер лигирования на малые аликвоты (по 5-10 мкл) чтобы исключить многократное количество циклов размораживания-замораживания. Срок годности 1 год с даты проверки.

 

1. Приготовление реакционной смеси.
      10 мкл 2x буфера лигирования;
      9 мкл смеси ДНК-вставки и линеаризованного вектора в необходимом соотношении (в молярном соотношении 3:1);
      1 мкл ДНК-лигазы фага T4.
После добавления фермента аккуратно перемешать содержимое пробирки и сбросить реакционную смесь на дно пробирки кратковременным центрифугированием. 2. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. 3. Перед трансформацией необходимо очистить лигазную сместь от PEG c использованием любого коммерческого набора для очистки ДНК из реакционных смесей или фенол/хлороформ и далее трансформировать в компетентные клетки.