Техническое описание
Набор 2x ПЦР-РВ премикс с UDG предназначен для проведения реакции полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с флуоресцентными зондами. В набор входит 2x реакционный буфер со стабилизаторами, ионами магния и дезоксинуклеозидтрифосфатами, а также смесь ферментов (в отдельной пробирке) состоящая из Taq ДНК-полимеразы с блокирующими антителами и урацил ДНК-гликозилазы (UDG). Также в наборе присутствует вода, обработанная ДЭПК для разведения и доведения реакционной смеси до нужного объема. Для проведения реакции необходимо только добавить образец, праймеры и флуоресцентно меченный зонд.
Условия хранения
Набор 2x ПЦР-РВ премикс с UDG рекомендуется хранить при температуре -18 – -20°C. Допускается транспортировка на сухом льду, однако необходимо избегать многократных циклов замораживания/оттаивания ферментативной смеси (при -20°C ферментативная смесь жидкая, но на сухом льду замерзает). Срок годности при соблюдении условий хранения и транспортировки – 12 месяцев.
Рекомендуемые условия реакции
После размораживания пробирки с буфером (Буфер) необходимо тщательно перемешать, несколько раз перевернув пробирку и сбросив содержимое на дно центрифугированием. Далее готовят реакционную смесь при комнатной температуре следующего состава (см. таблицу ниже). Пробирку с ферментом (Фермент) следует доставать с -20°C только для того, чтобы отобрать необходимый объем (не нагревать пробирку до комнатной температуры). Готовую смесь необходимо деликатно
перемешать. В реакционной смеси урацил ДНК-гликозилаза UDG (температура 25-40°C) находится в активном состоянии, а Taq ДНК-полимераза в неактивном состоянии.
Типовой протокол ПЦР:
1) удаление следов контаминации с помощью UDG , 37°C .........................................................................10 мин
2) денатурация ДНК, инактивация UDG, активация Taq ДНК-полимеразы, 95°C ...................................... 30 сек-2 мин
3) денатурация ДНК , 95°C ............................................................................................................................. 10 сек
4) отжиг праймеров, элонгация и запись сигнала, 55-65°C ......................................................................... 30 сек
стадии 3-4 повторяют 30-45 раз.