OneStep RT премикс, 100 реакций по 25 мкл
Техническое описание
Набор OneStep RT премикс предназначен для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с флуоресцентными зондами одношаговым методом. В набор входит реакционный буфер
(OneStep RT буфер) со стабилизаторами, ионами магния и дезоксинуклеозидтрифосфатами, а также смесь ферментов (OneStep RT фермент) состоящая из Taq
ДНК-полимеразы с блокирующими антителами и модифицированной MMLV ревертазы. В наборе также имеется пробирка с водой (1.6 мл), обработанной диэтилпирокарбонатом. Для проведения реакции необходимо только добавить РНК-матрицу, праймеры и флуоресцентно меченный зонд.
Условия хранения
Набор OneStep RT премикс рекомендуется хранить при температуре -18 – -20°C.
Допускается транспортировка на сухом льду, однако необходимо избегать многократных циклов замораживания/оттаивания ферментативной смеси (при -20°C ферментативная смесь жидкая, но на сухом льду замерзает). Срок годности при соблюдении условий хранения и транспортировки – 12 месяцев.
Протокол
После размораживания буферный раствор необходимо тщательно перемешать,
несколько раз перевернув пробирку и сбросить капли на дно пробирки с использованием центрифуги. Реакционную смесь для ОТ-ПЦР-РВ следует готовить на льду и
она имеет следующий состав (на реакцию 25 мкл):
• 13.25 мкл — OneStep RT буфер
• 11,25мкл — Праймеры и флуоресцентно меченный зонд до необходимой
финальной концентрации (например 500 нМ), вода, РНК матрица
• 0.5 мкл — OneStep RT фермент (фермент достают с -20°C только чтобы отобрать
необходимый объем, нагревать до комнатной температуры его не нужно).
Готовую смесь необходимо деликатно перемешать, после чего проводят реакцию
ОТ-ПЦР-РВ по следующему протоколу (приведен типовой протокол):
1) синтез первой цепи ДНК 45°C 20 мин
2) денатурация ДНК 95°C 3-5 мин
3) денатурация ДНК 95°C 10 сек
4) отжиг праймеров, элонгация и запись сигнала 55-65°C 30 сек
стадии 3-4 повторяют 30-45 раз